10x 3’单细胞核

充分利用10x Genomics Chromium微流控体统，达成完成回文编码字段标示贴差异有差异細胞和转录本。微流控体统缓冲区直径为有大有小一遍完成一种細胞。第一步在缓冲区添建立中含标示贴的凝露的作用的作用微珠，单独一些細胞和单独一些中含标示贴的凝露的作用的作用微珠联系，这两种方法被建立的油包囊到一种液滴中，变成油包水工作体系。凝露的作用的作用微珠上中含多包含了凝露的作用的作用微珠炎症因子朋友Barcode回文编码字段、原子炎症因子朋友UMI回文编码字段和polyT回文编码字段的引物回文编码字段，将細胞裂解后mRNA原子被引物回文编码字段中的polyT抓取，PCR扩增后变成携中含Barcode和UMI回文编码字段的cDNA，只能达成将有差异細胞原因的有差异 mRNA原子上加标示贴。

Gel beads在转录组测序中的作用是捕获细胞中的mRNA，每个微珠表面携带有几十万个Oligo序列（如下图）。Oligo dT序列由4个部分组成：read1用于上机测序；第二段是16bp 的10x barcode序列,每一个Gel Beads都携带不同的barcode , 可标记获取的mRNA都来自于哪一个细胞；第三段UMI长度为12bp, 可以将转录本序列进行绝对定量，避免扩增产生偏好；第四段是30bp的ployT，用于捕获有ployA尾的转录本。

对制取好的单组织组织悬液最先来质监，质监达标率后与Gel Beads和油分离融入到Chromium Chip G的的不同绿色通道，经途微气固两相流“T字”重叠系统的转变成GEM。完了组织组织裂解，Gel Beads自动的降解挥发广泛引物编码序列，与带异PolyA的mRNA来大逆转录，添加带异10x Barcode和UMI短信的cDNA最链。

样本起始量与送样建议

组织类型	新鲜组织、新鲜悬液或速冻组织
血细胞面积	＜40 μm
人体细胞生物	>85%（要尽可能的避开内部团/勾玉/钙镁离子等）
細胞密度	700~1200 cells/μL
人体细胞总产量	＞50万

主要要点：详细介绍样版注意指引，请找优酷云客户服务中心。

生物信息学分析内容

代表性文章

【1】Zheng H , Pomyen Y , Hernandez M O , et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018.
【2】Park J , Shrestha R , Qiu C , et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease[J]. Science, 2018:eaar2131.

案例展示

Hepatology：单细胞分析显示肝癌干细胞的异质性
论文标题：Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
刊登日期：2018年7月
发表杂志：Hepatology
影响因子：14.079
研究机构：美国国家卫生研究院国家癌症研究所、曼谷朱拉蓬研究所、弗雷德里克国家癌症研究实验室
样本类型：肝癌细胞系（HuH1和HuH7) ，手术切除肿瘤样本P1
技术手段：单细胞测序（10X Chromium、SMART-seq）、流式分选

研究背景

肝细胞癌（HCC，hepatocellular carcinoma）的肿瘤内分子异质性部分归因于肝癌干细胞（CSC，hepatic cancer stem cells）的存在。由各种细胞表面标志物定义的不同CSC群体可能包含不同的致癌驱动因素，这在定义靶向疗法时构成了挑战。研究人员在单细胞水平（10X Chromium、SMART-seq）上整合转录组学和功能分析用以评估CSC的异质性程度。结果表明，CSC在单细胞水平上的表型、功能和转录均存在异质性性，不同的CSC亚群具有不同的分子特征。而且有趣的是，不同CSC亚群内的不同基因与HCC预后相关，并且彼此相互独立，表明CSC异质性影响肿瘤内异质性和肿瘤进展。

好的文章没想到

大量数据表明CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等表面标志物可以定义CSC，研究人员选择CD24、CD133、EpCAM分选HuH1和HuH7不同细胞亚群，用于研究CSC生物学和分子水平异质性。免疫荧光染色表明，在两种细胞培养形态下（单层培养、球体培养）,两个HCC细胞系均表现出明显的细胞异质性。

HuH1和HuH7癌组织膜系（最原始癌组织膜数区分是1343、1134）常见致力于和乏氧致力于（加快癌组织膜混干）2周后，探究员工独立行使几种从表面标制图案物（CD24、CD133、EpCAM）分选癌组织膜，HuH1和HuH7招标制图案物弱阳反应的CSCs比重区分为15-20%、8-12%，而标制图案物假弱阳CSCs比重只要有0-5%（下面的图A-B），致力于后与众不同癌组织膜亚群的自我发展更新系统作用距离比较大（下面的图C-D）；分选后的癌组织膜根据2个月致力于后，和未分的得癌组织膜比起来，CD133+、EpCAM+、CD24+、Triple+癌组织膜要拉大形成分层CSCs，而杀灭下的Triple-癌组织膜要拉大成分层CSCs，也许是在环节癌组织膜如果不是真正意义的箭头假弱阳癌组织膜，亦或是箭头假弱阳癌组织膜亲身经历了改变成为箭头弱阳反应癌组织膜（下面的图E）。

钻研人数利用SMART-Seq策略分折HuH1和HuH7抗体阳性标签图片内部或是分选的P1（分选CD133+/CD24+/EpCAM+/CD45-内部）内部展现谱（单独的内部测序、10内部混后测序、100内部混后测序）问题，并与数值之中人胚胎干内部（hESC）、鼠内皮内部（mEC）和鼠造血干内部（mHSC）展现谱数值当了特别，看见各个内部类群极具各个的dna展现格局，且各个类型、内部中不相同内部的dna展现格局均来源于差距，HuH7内部间差距高于HuH1；当内部混后（10内部混后、100内部混后）后这一种差距地步分明减少（如图所示A）。而当单独的聚类分析法HuH7内部时，看见各个标签图片内部相互可鉴别（如图所示B）。这数值均是因为单内部水平面上转录组来源于异质性。

科研人工相对了HuH7弱阳记号神经元（Triple+）和阴记号神经元（Triple-）表观遗传遗传表答异同，鉴定结论到的286个Triple+一些表观遗传遗传能予测存在LCI序列的240例肿癌模板、存在TCGA的250例肿癌模板的局部环境率，但在非肿癌模板中不知情义。

与众多种图标CSC上皮受损癌细胞受众目标受众群体表观遗传表示相对概述，EpCAM+、CD133+、CD24+、Triple+基本特征英文表观遗传主要不重叠（右图A），IPA通道概述也意味着与众多种上皮受损癌细胞受众目标受众群体的通道可是重叠（右图C-F），而与众多种上皮受损癌细胞受众目标受众群体基本特征英文表观遗传可能广泛用于生活期預測，且EpCAM+、CD133+比CD24+更有特点（右图B）。

为着建筑体理解体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核团队多彩性，科学研究考生运用10X 单体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核测序办法，对3846个HuH1、HuH7、P1体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核确定了定量分析， HuH1能构成两个亚群，HuH7构成4个体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核亚群，P1构成3个体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核亚群，体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核聚类算法效果与与SMART-seq效果相近（如图是A）。CSC标准物，比如EpCAM、CD133 (PROM1)、CK-19 (KRT19) 和乙醛脱氢酶 (ALDH1A1) （如图是B）甚至HCC特异人类基因，AFP、MDK、GPC3、GOLM1、YY1AP1、PLK1, ECT2、NELFE（如图是C）在不一体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核亚群中呈现方式现实存在的异质性。P1的3个体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核亚群中呈现方式了林中指数公式 (KLF4、POU5F1、MYC)，干体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核marker (NANOG)，白体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核marker(PTPRC), T体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核 markers (CD3E, CD8A) 和B体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核marker (CD79A) ，但其呈现方式也现实存在的异质性，这其中第1 个和第二点个P1亚群为HCC侵润性白体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核（依次呈现方式T体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核marker和B体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核marker），最后个P1亚qq群主为了HCC体生殖肿瘤癌癌生殖神经元膜膜核（如图是D）。

参考文献

Hongping Zheng,et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2018, doi：10.1002hep.29778

结果展示

1. 单受损细胞亚群类型

针对PCA结果中选取前10个主成分，采用graph-based聚类方法对细胞进行分类。使用相同的数据进行t-SNE分析，然后将聚类结果在t-SNE映射中展示。

2. Markerdna深入分析
细胞群体Top10 Marker基因的小提琴图和表达映射图

3. 区别基因遗传KEGG聚集性概述

Pathway通路图展示与说明：红色代表注释到某个ko节点且上调的显著差异表达转录本，蓝色代表注释到某个ko节点且下调的显著差异表达转录本，橘黄色代表注释到某个ko节点不仅有上调又有下调的显著差异表达转录本。方框内的4位数字表示各种酶的EC编号；空心圆圈表示小分子化合物；实心箭头表示生化反应的方向；虚线箭头连接其他的相关代谢途径。下图仅为报告中的展示图片

常见问题（FAQ）

1、单细胞转录组测序需要做重复吗？

单细胞测序的目的在于鉴定细胞群体中的不同亚群、得到新的重要分子标志物和鉴定稀有细胞亚群等，因此更多的是关注细胞和细胞之间的差别。从目前已有的文献看，对重复数没有强制要求。但从近期的发文趋势来看，建议每组设置样本数3~5 个，临床样本根据实际情况建议每组 5 例以上。

2、组织样本如何制备单细胞悬液？

单细胞转录组测序目前没有一个统一的样本制备方法，针对于不同的组织样本，有不同类型的样本单细胞制备方法。此外，可以具体根据老师提供的具体样本类型，查阅相关的文献，探讨适合于老师样本的单细胞悬液制备方法。

3、单细胞转录组每个细胞能捕获到多少个基因？

根据不同的细胞类型，捕获到的基因数会有区别，有些细胞类型高的会在3000左右，而有些大概在1000左右。基因检出数与样本状态有关，不同类型的样本，基因检出数可能存在数倍的差异。

10x 3’单细胞核

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