环路示踪

　　神经元之间的环路连接非常复杂，完整而准确地显示这些环路的结构和变化，对揭示许多疾病的病因和新治疗方法的开发具有非常重要的意义。

　　

　　传统的神经示踪方法如电镜、Golgi染色、染料、肽类标记物等可以显示神经元的形态和投射，少数示踪剂如WGA、TTC等还可以实现跨突触标记，但这些方法都具有信号间接、方向不特异、跨突触后信号衰减严重等缺点，最重要的是，这些染料无法携带基因，因此只能显色。自20世纪80年代，Kristensson首次应用单纯疱疹病毒（HSV）跨突触标记神经元后，各种各样病毒载体在环路示踪方面的应用越来越受到重视。

　　

　　但需要注意的是，虽然这类嗜神经病毒对于神经环路的标记具有很强的感染性和特异性，但其免疫原性很强，动物往往在注射后数天死亡，无法进行行为测试或者生理研究，目前更适用于寻找未知的神经环路，此外此类病毒需要PII以上等级的实验室。因此，越来越多的研究使用AAV进行环路示踪标记。由于AAV本身无复制能力，且其免疫原性极低，因而其不会造成大量的毒害，亦不会影响动物的正常生理，故AAV成为最常用的环路示踪工具病毒载体。

　　

　　神经元是具有极性的细胞，信息从上一级神经元的轴突通过突触传递到下一级神经元的树突，之后发生树突、胞体的信息整合，并通过轴突再次发出。因此涉及神经环路的标记包括方向性（顺向：胞体至轴突的标记；逆向：轴突至胞体的标记）和是否跨突触两大基本问题（图1）。

　　

　　图1 神经环路示踪技术的目标（改自Peter L Strick, et al., eLS, 2011）

　　

　　环路示踪应用案例

　　

　　1、基于AAV的顺向非跨突触标记

　　

　　① 客户发表文章：Science. (IF=41.058). Mu D,et.al. (2017). A central neural circuit for itch sensation. [腺相关病毒, 痒, 光遗传,化学遗传]

　　

　　注射部位：小鼠PBN

　　

　　载体：AAV-hSyn-HA-hM4Di-IRES-mCitrine

　　

　　血清型：AAV2/9

　　

　　病毒滴度：1.0× 1013 VG/mL

　　

　　注射体积：150nl

　　

　　观察时间：3周

　　

　　② 客户发表文章：Neuron. (IF=14.319). Tian-Le Xu,et.al. (2019). Central Processing of Itch in the Midbrain Reward Center. [AAV，痒，光遗传学]

　　

　　注射部位：Vgat- Cre小鼠VTA

　　

　　载体：AAV-EF1a-DIO-ChR2(H134R)-mCherry

　　

　　血清型：AAV2/8

　　

　　病毒滴度：7.39×1012 VG/mL

　　

　　注射体积：300-400nl

　　

　　观察时间：2-3周

　　

　　2、基于AAV的逆向非跨突触标记—rAAV2-retro

　　

　　① 客户发表文章：Biological Psychiatry. (IF=11.984). Bing Xing Pan,et.al. (2018). Chronic stress causes projection-specific adaptation of amygdala neurons via SK channel downregulation. [腺相关病毒, 焦虑症, 光遗传]

　　

　　注射部位：小鼠dmPFC、VHPC

　　

　　载体：AAV2/1-retro-Syn-eYFP-Cre、AAV2/8-CaMKIIα-DO-SK2&AAV2/8-CaMKIIα-DIO-SK2-mCherry

　　

　　注射体积：300nl

　　

　　观察时间：4周

　　

　　② 内部测试结果

　　

　　注射部位：小鼠BPN

　　

　　载体：rAAV2-retro-hSyn-EYFP

　　

　　观察时间：4周

　　

　　3、基于AAV的跨突触标记

　　

　　3.1 基于AAV的顺向跨突触标记-- rAAV2/1

　　

　　① 客户发表文章：Nature Neuroscience. (IF=19.912). Yao J,et.al. (2018). A corticopontine circuit for initiation of urination. [腺相关病毒, 神经环路]

　　

　　注射部位：小鼠皮层M1、PMC

　　

　　载体：rAAV2/1-hSyn-Cre&rAAV2/9-DIO-hChR2(H134R)-mCherry、rAAV2/9-DIO-GCaMP6s

　　

　　病毒滴度：rAAV2/1: 5 × 1012 VG/mL；rAAV2/9-DIO-hChR2：1.2 × 1013 VG/mL；rAAV2/9-DIO-GCaMP6s：0.5 × 1012 VG/mL

　　

　　注射体积：多点注射，每位点30-40nl

　　

　　观察时间：4周

　　

　　② 客户发表文章：Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相关病毒, 成瘾, AAV1, AAV-WGA-Cre]

　　

　　注射部位：小鼠皮层BLA

　　

　　载体：rAAV2/1-hSyn-Cre-EGFP

　　

　　病毒滴度： 1.13 × 1013 VG/mL

　　

　　注射体积：60nl

　　

　　观察时间：5周

　　

　　3.2 借助WGA的跨突触标记—AAV-WGA-Cre

　　

　　客户发表文章：Science Advances. (IF=11.511). Ping Zheng,et.al. (2019). Crucial role of feedback signals from prelimbic cortex to basolateral amygdala in the retrieval of morphine withdrawal memory. [腺相关病毒, 成瘾, AAV1, AAV-WGA-Cre]

　　

　　注射部位：小鼠PrL

　　

　　载体：AAV-hSyn-mCherry-IRES-WGA-Cre

　　

　　病毒滴度：4.28 × 1012 VG/mL

　　

　　注射体积：300nl

　　

　　观察时间：4周