Nat Commun | 强大了！用T人体神经元杀掉“T人体神经元”，还就不会打伤友军

前言

2023年4月，天津城市交通上大学杨选明团对在Nature Communications投稿“T cell receptor β-chain-targeting chimeric antigen receptor T cells against T cell malignancies”，该科学研究充分利用T人体组织生殖细胞恶劣癌症中T人体组织生殖细胞感觉（T cell receptor, TCR）β链可变性区的活性聊天，设计的和建立嵌合抗原感觉（chimeric antigen receptor, CAR），使用一型号休外和胃中实验室表明这一种CAR-T人体组织生殖细胞治愈原则的健康性和管用性。  

背景介绍

T神经元核恶劣良性癌症然而在癌症化疗下克服率较高，但很多用户良性癌症确实会恶变，而T神经元核恶劣良性癌症疾患原则错综多样化，小分子式靶向药物的制疗措施没办法设计规划，因为临床试验肯定必须要新的制疗方式。CAR-T神经元核在B神经元核来源地的儿童白血病中显视出较好的制疗效率，但用它制疗T神经元核恶劣良性癌症仍旧存在往往比较困难。譬如CAR-T神经元核的化学合成时候中沾有良性癌症神经元核，与CAR-T神经元核自相破坏力，或破坏力正常值T神经元核。为不要这样的方面，必须要首选良性癌症神经元核特异表明的抗原。   在T组织膜健康成长期间中，TCR产品性來起源于α链或β链可变气门正时性-产品-去连接区型式域（variable-diversity-joining-domain, VDJ-domain）的DNA重排。TCR β链可变气门正时性区的识别码DNA涉及5俩个Vβ细节描写，4个D细节描写和13个J细节描写，互相在人体肌肉中VβDNA细节描写有24个家簇，各个T组织膜克隆3个区各仅选定 4个细节描写去搭配，以至于，日常值TCR冷库中单独一个相关TCR Vβ亚型的突然出现頻率一般在0.58-10.84%。而进步为T组织膜恶变癌肿的T组织膜克隆极为单，常见只能有4个相关的TCR Vβ及Vα亚型。写作者再生利用一项特喜欢的人鉴别癌肿组织膜和日常值T组织膜，并广泛应用于CAR-T组织膜构思。  

研究思路
 

01  针对特定的Vβ亚型设计CAR-T细胞，检测CAR-T细胞自身靶点表达，并通过与正常T细胞，以及Vβ8^-和Vβ8⁺配对细胞系共培养，检测Vβ8-CAR-T细胞的杀伤表型。

02  在长期持续抗原刺激下检测Vβ8-CAR-T细胞增殖、维持和杀伤能力。

03  在免疫缺陷小鼠模型中验证Vβ8-CAR-T细胞的抗肿瘤效果。

04  对靶向Vβ5的CAR-T细胞杀伤表型进行重复验证，拓宽策略适用范围。

05  检测特定亚型Vβ的T细胞缺失后对适应性免疫的影响，验证CAR-T治疗策略安全性。

研究内容
 

 首先，作者利用能够特异性识别TCR β链可变区不同V区结构域（Vβ8, Vβ5, Vβ13）的抗体，分析其氨基酸序列后提炼出相应的单链可变片段（single-chain variable fragment, scFv），并将该序列与4-1BB和CD3ζ序列整合构建CAR，用激活的原代T细胞制备靶向不同Vβ亚型的CAR-T细胞。对这些CAR-T细胞自身分别检测特定Vβ亚型阳性率，发现这些CAR-T细胞确实能特异性消除各自靶向的Vβ亚型阳性的正常T细胞，而对总Tαβ表达没有影响。将Vβ8特异的CAR-T细胞与正常T细胞共培养后，Vβ8⁺ T细胞类群比例明显下降，并且上清检测出细胞毒性相关的细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌显著增多。

 

接下来，作者利用293细胞和Jurkat细胞分别构建配对的Vβ8^-和Vβ8⁺细胞，并与对照T细胞或Vβ8-CAR-T细胞共培养，发现只有当Vβ8⁺细胞与Vβ8-CAR-T细胞共培养时，才能检测到T细胞IFN-γ、TNF-α的释放，以及granzyme B的表达，Vβ8⁺ Jurkat细胞才能被特异性杀伤，并且激活的caspase-3表达水平显著上升，表明细胞凋亡增加。

 

 

为了检测CAR-T细胞长期增殖和细胞毒性杀伤能力，作者利用辐照的Vβ8⁺ Raji细胞作为抗原持续重复刺激Vβ8-CAR-T细胞。通过检测多个不同供体来源的CAR-T细胞，作者发现这种重复的抗原刺激能够不断增加Vβ8-CAR-T细胞数目，无需为T细胞扩增做额外的基因改造，也没有出现靶向CD3或CD5的CAR-T细胞中互相杀伤的现象。而细胞毒性检测实验表明，与对照T细胞相比，不同刺激阶段的Vβ8-CAR-T细胞均能显著提升对Vβ8⁺ Jurkat细胞的杀伤。

 

  著者进一歩在内部手机验证Vβ8-CAR-T上皮癌癌症癌内部的抗癌肿效果好，其用免疫抗体缺欠的NSG小鼠树立Jurkat上皮癌癌症癌内部异种复制模式，静脉血管针剂相较比较T上皮癌癌症癌内部亦或是Vβ8-CAR-T上皮癌癌症癌内部，报告单表示经Vβ8-CAR-T上皮癌癌症癌内部控制的小鼠，流式组织术测试其外周血、脾脏和骨髓中的癌肿上皮癌癌症癌内部生长率分明的降，活体影像凸显各期限点癌肿工况分明的减轻，总能率可观改善。  

 

利用Vβ8靶点证明靶向Vβ的策略有效后，作者并不满足于此，希望将适用范围拓展到其他T淋巴细胞肿瘤。为此，作者构建了Vβ5-CAR-T细胞，以及Vβ5阳性的肿瘤细胞CCRF-CEM和Hut-78 T细胞系。与靶向Vβ8的实验结果一致，在Vβ5-CAR-T细胞制备的过程中，自身表达Vβ5的正常T细胞被清除。体外共培养实验中，Vβ5-CAR-T细胞能够特异性杀伤Vβ5⁺的CCRF-CEM和Hut-78 T细胞，并且仅在它与Vβ5⁺细胞共培养时分泌IFNγ。同样在体内实验中，Vβ5-CAR-T细胞注射能够显著降低Vβ5⁺的CCRF-CEM异种移植肿瘤负荷，并且显著延长荷瘤小鼠生存期。

 

 

靶向Vβ的策略虽然显示较好的抗肿瘤效果，但仍存在一定风险，CAR-T细胞会攻击自身表达所靶向Vβ亚型的正常T细胞，故作者接下来对这一策略安全性进行评估。因为体内某特定Vβ亚型的T细胞仅占所有T细胞的一小部分，作者猜测相比于靶向所有T细胞（例如CD5、CD7或CD3）的CAR-T治疗策略，这一小部分T细胞的缺失不会产生严重的免疫抑制。为了验证这一猜想，作者建立了选择性去除Vβ8⁺ T细胞的小鼠模型。Vβ8特异性抗体的检测表明小鼠中Vβ8⁺ T细胞约占总正常T细胞的21.5%。作者利用相同scFv片段制备Vβ8重组抗体，模拟长期Vβ8⁺ T细胞的缺失，并用CD3ε抗体处理的小鼠作为阳性对照。

 

随后作者对该小鼠模型注射DEC-OVA疫苗，发现Vβ8抗体处理的小鼠产生DEC-OVA抗体的水平，以及OT-I特异的T细胞应答水平与野生型小鼠类似，而CD3ε抗体处理的小鼠产生的DEC-OVA抗体显著减少，OT-I特异的T细胞应答则完全被抑制。作者进一步对接种B16-OVA肿瘤细胞的小鼠进行抗肿瘤免疫检测，发现Vβ8⁺ T细胞缺失小鼠的肿瘤生长曲线与野生型小鼠基本一致，而由CD3ε抗体处理后所有T细胞缺失的小鼠肿瘤生长更加迅速。因此Vβ8⁺ T细胞缺失的小鼠细胞和体液免疫反应几乎不受影响。

 

   综上所述，文章利用TCR β链可变区的特定亚型作为靶点，建立特异性的CAR-T细胞治疗策略，并证明该策略能够有效杀伤特定亚型的T细胞恶性肿瘤，同时保留充分的适应性免疫功能，对临床有一定的指导意义。

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