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【Nat Commun.】SARS-CoV-2 N血清提高NLRP3支原体感染小体更改密码加重高炎表现

时长：2021-11-10 转化率：
暨南大学吴建国教授/潘攀研究团队，在Nature子刊《Nature Communication》发表题为“SARS-CoV-2 N protein promotes NLRP3 inflammasome activation to induce hyperinflammation”（DOI: 10.1038/s41467-021-25015-6 ），该研究展示了SARS-CoV-2 N蛋白通过促进NLRP3炎症小体激活诱导高炎症反应；N蛋白促进促炎因子的成熟，并诱发细胞和小鼠的促炎反应；N蛋白直接与NLRP3蛋白相互作用，促进NLRP3与ASC结合，促进NLRP3炎症小体组装；N蛋白加重脓毒症和急性炎症小鼠模型中肺损伤，加速死亡，促进小鼠IL-1β和IL-6激活。
 

SARS-CoV-2 N蛋清引导癌细胞和小鼠促炎发生反应

关键在于，SARS-CoV-2病毒感染巨噬血上皮癌细胞和树突血上皮癌细胞(DCs)后许多促炎分子趋化分子及配体均有不一样的能力增长；深入分析专业人员对SARS-CoV-2球淀粉酶对IL-1β减少的会影响来进行深入分析，WB可是展现N球淀粉酶在HEK293T血上皮癌细胞表答爱是最低的(Fig.1c)，ELISA可是展现N球淀粉酶表答爱的HEK293T-NLRP3真菌感染小体管理体制IL-1β是最低的(Fig.1d)，SARS-CoV-2 N球淀粉酶搞好Nigericin诱骗的IL-1β排出(Fig.1e)。由于SARS-CoV-2 N球淀粉酶在IL-1β成熟稳重及排出中发挥帮助极为重要帮助。N球淀粉酶介导THP-1包函IL-1β其中的真菌感染分子表答爱， MCC950(NLRP3特喜欢的人减缓剂)可不可以减缓给出真菌感染分子的表答爱(Fig.1g)。回收利用AAVlung-N在小鼠肺中表明N球蛋白，AAVlung-N还可以特殊不断增加IL-1β，IL-6，TNF，CXLC10，CCL2，IL-11，IL-7和CXCL8的mRNA表达出来，此外Ac-YVAD-cmk(Caspase-1调节剂，中医IL-1β成长期)和MCC950对AAVlung-N引导的出现神经细胞表达爱均有与众不同的情况的恢复功能效应(Fig.1h&1i)。于是，探析技术人员预测未来N蛋清可以淡化NLRP3炎性小体刺激，而使引导完善IL-1β分秘，行而在引导细菌感染神经细胞和神经细胞神经细胞中表现重点效应。最后呈现，SARS-CoV-2 N蛋清在引导促炎神经细胞中表现重点效应，N蛋清或者组织调接NLRP3细菌感染小体的刺激。

 
Fig. 1 SARS-CoV-2 N淀粉酶诱惑疾病反响
 

SARS-CoV-2 N蛋白诱导IL-1β成熟和IL-6产生

需要想到激情剂对促炎因子表达的主导作用，接下来研究人员对SARS-CoV-2 N蛋白在IL-1β成熟中的作用进行研究。研究发现N蛋白可以促进IL-1β的分泌、IL-1β cleavage和Caspase-1成熟且呈现剂量依赖，LPS+ATP和LPS+Nigericin均可诱导IL-1β的分泌和cleavage，N蛋白可以进一步促进IL-1β的分泌和cleavage(Fig.2a&2b)。LPS+ATP和LPS+Nigericin可以促进THP-1细胞IL-18和IL-6，N蛋白仅能促进IL-6的分泌，不能促进IL-18的分泌，MCC950抑制IL-1β和IL-6分泌；LPS+ATP或LPS+Nigericin同样可以促进BMDM细胞的IL-1β和IL-6的分泌，并且在NLRP3-/-小鼠BMDM中LPS+ATP或LPS+Nigericin对IL-6和IL-1β分泌并无显著促进作用(Fig.2c-2j)。综上所述，N蛋白诱导IL-1β的成熟和IL-6的产生，并揭示NLRP3是N诱导IL-1β分泌和IL-6产生所必需的，因此N蛋白可能在NLRP3炎症小体的激活中发挥重要作用。
 

Fig.2 N淀粉酶帮助IL-1β成长和IL-6绘制

 

SARS-CoV-2 N蛋白与NLRP3交互作用

接下去来研究方案探讨者对SARS-CoV-2 N球球核蛋清酶酶在NLRP3疾病小体调高中的反应使用研究方案探讨。CO-IP报告显示信息，N球球核蛋清酶酶仅与NLRP3球球核蛋清酶酶主动反应，且His-N球球核蛋清酶酶能能单独与NLRP3球球核蛋清酶酶联系(Fig.3a-3e)，N球球核蛋清酶酶和NLRP3共定位功能于内部质中，N球球核蛋清酶酶与ASC无交互式反应(Fig.3f-3i)。全部，N球球核蛋清酶酶特男人与NLRP3球球核蛋清酶酶主动反应，调高NLRP3疾病小体外分泌。
 

Fig.3 SARS-CoV-2 N核血清与NLRP3核血清双方用处

 

N蛋白参与NLRP3炎症小体激活

通过评估N蛋白的截短突变体N1-N8，鉴定参与NLRP3相互作用的SARS-CoV-2 N蛋白序列。结果表明，NLRP3蛋白与N1、N5、N6和N7相互作用，并且IL-1β分泌、IL-1β cleavage和Caspase-1 p20 maturation 亦受N蛋白N1、N5、N6和N7影响(Fig.4a-4e)，因此，N蛋白260aa-340aa截短体参与了与NLRP3的相互作用并激活NLRP3炎症小体。
 


 

Fig.4 N淀粉酶截短体参与进来NLRP3感染小体成功激活
 

N血清提高网站NLRP3与ASC的间接用途

接下去来探索职工对N淀粉酶在控制NLRP3细菌感染小体化学物质中的角色完成探索。結果展现，N淀粉酶对NLRP3、Caspase-1和ASC的淀粉酶级别没得关系，然后NLRP3会有时N和ASC应该完美免役析出(Fig.5a-5e)。于是，该結果表示N淀粉酶、NLRP3和ASC5个淀粉酶将行成一款 有难度的N-NLRP3-ASC挽回物。N淀粉酶激发NLRP3与ASC的完美角色在HEK293T和A549肿瘤细胞系并呈含水量依耐(Fig.5f-5g)。一致，在PMA-differentiated THP-1-N肿瘤细胞系中，Nigericin推进 N淀粉酶在NLRP3会有的症状下与内源性ASC完美角色(Fig.5h)。于是，SARS-CoV-2 N 推进NLRP3与ASC的完美角色。
 


 

Fig.5 N淀粉酶增强NLRP3与ASC的相互间的作用
 

SARS-CoV-2 N蛋白质提高NLRP3炎性小体组成的

对NLRP3在内部质中展开追踪位置产品定位，NLRP3呈弥条状匀称不均于内部质，而SARS-CoV-2 N淀粉酶现实具备时，NLRP3呈聚在一起的色斑状(Fig.6a)，SARS-CoV-2 3a淀粉酶与NLRP3共追踪位置产品定位，但尚未导致色斑状聚在一起。SARS-CoV-2 N2和N8 截短体，同時匀称不均在内部核和内部质中且是不能与NLRP3和共追踪位置产品定位，NLRP3在HEK293T内部的内部质中未导致色斑状聚在一起(Fig.6b&6c)。THP-1内部中NLRP3匀称不均与HEK293T内部和A549内部近乎保持一致，且N淀粉酶现实具备时，内源性NLRP3淀粉酶在内部质中聚在一起导致色斑(Fig.6d&6e)。于是，SARS-CoV-2 N淀粉酶概率推动NLRP3支原体感染小体挽回体的导致。
THP-1神经元和BMDM神经元中，Nigericin促使内源性ASC蛋清oligomerization，同时N蛋清能能力促会上述想法(Fig.6f&6g)。与此同时，HEK293T-NLRP3神经元分辨转染代码SARS-CoV-2-N蛋清举例说明截短甲基化体，ASC oligomerization被N1、N5、N6和N7蛋清提高，而免受N2、N3、N4、N8蛋清的影响(Fig.6h)。故，N蛋清队列260aa-340aa与NLRP3互不效用，力促会ASC oligomerization。
 


 

Fig.6 N蛋清使得NLRP3群聚和ASC oligomerization

 
此外，研究人员还探究了N蛋白对NLRP3炎症小体复合物组装的影响。将HEK293T细胞或A549细胞共转染不同质粒，GFP同时分布于细胞核和细胞质中，NLRP3弥散状分布于细胞质(Fig.7a&7b(a-e));N蛋白和NLRP3表达时，NLRP3与N蛋白共定位，呈斑点状(Fig.7a&7b(f-j));GFP和ASC表达时，GFP与ASC同时分布于细胞核和细胞质中，并形成小的环状结构(Fig.7a&7b(k-o))；N蛋白和ASC表达时，N蛋白和ASC无法共定位(Fig.7a&7b(p-t))；GFP、ASC和NLRP3同时表达时，NLRP3和ASC共定位于细胞质并形成环状结构(Fig.7a&7b(u-y))；值得注意的是，当N蛋白、ASC和NLRP3同时表达时，3种蛋白共定位形成球状结构(Fig.7a&7b(z-d))；当3a、ASC和NLRP3同时存在时，3种蛋白共定位未能形成球状结构(Fig.7a&7b(ae-ai))。综上所述，SARS-CoV-2 N蛋白促进NLRP3炎性小体复合物拼装，而非SARS-CoV-2 3a蛋白。
 


 

Fig.7 N蛋白质推进NLRP3炎性小体主装

 

N淀粉酶启用NLRP3慢性炎症小体诱惑小鼠肺拉伤

收起来，研发者对SARS-CoV-2 N球淀粉酶质在修改密码NLRP3宫颈炎症小体的生物技术学效果完成评论。进行在C57BL/6小鼠把你想表达出来N球淀粉酶质，来探寻N球淀粉酶质在肺破损中的效果。滴注AAVlung-N的小鼠，血清中IL-1β和IL-6的横向很大低过對照组，且Ac-YVAD-cmk和MCC950均可抑止该表现(Fig.8a&8b)，但AAVlung抒发N淀粉酶尚未决定血清中IL-18的抒发(Fig.8c)。AAVlung感柒的小鼠肺天然免疫荧光效果呈现，AAVlung-N小鼠肝部IL-1β和IL-6把你想表达出来爱很明显大于其它组群，Ac-YVAD-cmk和MCC950均可拉低IL-1β和IL-6把你想表达出来爱(Fig.8d&8e)。HE印染提示，挟带AAVlung-N的小鼠肺里有分明的的炎症病损病损及聚集拉伤，Ac-YVAD-cmk和MCC950均可调节肺聚集的病损(Fig.8f)。这部分最终表面NLRP3炎性小体是N淀粉酶帮助的小鼠肺拉伤情况所必不可少的。
 


 

Fig.8 N核蛋白促活NLRP3感染小体介导小鼠肺挤压伤

 
ELISA没想到现示，AAVlung-N诱导NLRP3+/+小鼠IL-1β和IL-6的表达，在NLRP3-/-无明显影响，说明NLRP3在N蛋白介导的IL-1β和IL-6激活中不可或缺(Fig.9a&9b)，对IL-18激活没有影响（Fig.9c）。并且携带AAVlung-N的NLRP3+/+小鼠肺组织免疫组化结果IL-1β和IL-6的表达明显高于NLRP3-/-小鼠(Fig.9d&9e)。HE病理染色同样显示携带AAVlung-N的NLRP3+/+小鼠肺部有明显的炎症病变及组织损伤(Fig.9f)。因此，N蛋白通过激活NLRP3炎症小体诱导小鼠全身炎症，引发肺损伤。
 


 

Fig.9 NLRP3在N核蛋白引发的肺受伤中表现主要功用

 
综上说明说明，探究员工阐明了COVID-19的病理学制度化，但其中SARS-CoV-2 N蛋白质根据有助于NLRP3真菌感染小体的系统激活导致有助于真菌感染和肝部问题。
 


 

Fig.10 N血清根据激活卡NLRP3感染小体诱发肺影响3d模型

 

实验结论
 

 

在该学习中，学习人数在分折GEO大数据系统库(GSE155106)知道SARS-CoV-2影响巨噬癌内部和DCs会有利于增进会大规模癌内部因素和趋化因素的表明。在选择，学习人数知道SARS-CoV-2 N核蛋清酶在成功重置NLRP3炎性小体，有利于增进会慢性慢性炎症因素的表明引发小鼠肺挫裂伤，增加重量脓毒症类别小鼠的伤亡。N核蛋清酶直接性与NLRP3的作用，有利于增进会NLRP3炎性小体聚合物，为了成功重置NLRP3炎性小体。总而言之所讲，该学习效果查证SARS-CoV-2 N核蛋清酶在NLRP3慢性慢性炎症小体诱导型肺挫裂伤的新考核机制。

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