非编码RNA

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　　非编码RNA（Non-coding RNA）是指不编码蛋白质的RNA，包括miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等。非编码RNA发挥功能的方式很多，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种细胞活动，主要包括基因的激活和沉默，RNA的剪接、修饰和编辑，蛋白质的翻译等。

　　

　　1.miRNA：miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。

　　

图一 miRNA成熟及作用方式（Mikhailidis DP, Athyros VG. Nat Rev Cardiol. 2014 Feb;11(2):72-4.）

　　

　　 miRNA过表达：将miRNA前体序列构建入病毒载体中，该载体既可用于瞬时转染细胞，也可以包装成病毒用于稳定株筛选和动物水平过表达miRNA。

　　

　　miRNA敲低：设计针对miRNA的TuD RNA封闭片段或海绵片段，再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了可以直接瞬时转染细胞用于miRNA的敲低，也可以包装成慢病毒，用于动物水平敲低miRNA。

　　

　　miRNA靶基因预测：miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶基因的3’UTR区，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。因此，可以将目的基因的3’UTR区域构建到含luciferase的报告基因上，通过比较miRNA过表达或inhibitor 与报告基因作用检测荧光值的变化，判断miRNA对靶基因的作用。再通过对3’UTR区进行定点突变的方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

　　

　　miRNA常用数据库：

　　

　　 （1）miRbase（http://www.mirbase.org）：miRbase 是由曼彻斯特大学的研究人员开发的一个在线的miRNA数据库，提供包括已发表的miRNA序列数据、注释、预测基因靶标等信息的全方位数据库，是存储miRNA信息最主要的公共数据库之一。

　　

　　（2）TargetScan（http://www.targetscan.org/）：TargetScan是通过搜索和每条miRNA种子区域匹配的保守的8mer和7mer位点来预测靶基因。

　　

　　（3）TarBase（http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex）：TarBase数据库人工经历了长达10年左右的时间去搜集了实验验证过的miRNA的靶基因，包括在人、小鼠、果蝇、蠕虫和斑马鱼中的miRNA的靶基因。

　　

　　（4）miRWalk（http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/）：miRWalkis是一个综合性数据库，提供来自人类、小鼠和大鼠的miRNA的预测信息和经过验证的位于其靶基因上的结位点。

　　

　　2.lncRNA：lncRNA是长链非编码RNA（long non-coding RNA）的简称，是长度在200-100000 nt之间的RNA分子。大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中，都具有明显的时空表达特异性；序列上保守性较低，只有约12%的lncRNA可在人类之外的其它生物中找到。

　　

　　根据lncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，可以将其分为启动子区（promoter associated）、内含子间（intronic）、双向（bidirectional）、正义链（sense）、反义链（antisense）、3’UTR区（3’UTR associated）、基因间（intergenic）这7种类型。这种位置关系对于推测lncRNA的功能有很大帮助。

　　

　　图二 lncRNA分类（Huang X, et al.Cancer Lett. 2018 Jan 28;413:94-101.）

　　

　　一般来说，lncRNA主要从以下三种层面实现对基因表达的调控：

　　

　　（1）表观遗传学调控：lncRNA招募染色质重构复合体到特定位点进而介导相关基因的表达沉默。

　　

　　（2）转录调控：包括如下几种：1）lncRNA的转录能够干扰临近基因的表达；2）lncRNA能够通过封阻启动子区域来干扰基因的表达；3）lncRNA能够与RNA结合蛋白作用，并将其定位到基因启动子区从而调控基因的表达；4）lncRNA能够调节转录因子的活性；5）lncRNA也能够通过调节基本转录因子来实现调控基因的表达。

　　

　　（3）转录后调控：lncRNA能够在转录后水平通过与mRNA形成双链的形式调控基因的表达。

　　

　　lncRNA过表达：将lncRNA序列构建入病毒载体中，该载体既可用于瞬时转染细胞，也可以包装成病毒用于稳定株筛选和动物水平过表达lncRNA。

　　

　　lncRNA干扰：针对lncRNA设计干扰片段，再将该片段构建入病毒载体中。该载体除了可以直接瞬时转染细胞用于lncRNA的干扰，也可以包装成慢病毒，用于动物水平干扰lncRNA。

　　

　　lncRNA敲除：用CRISPR/Cas9技术对lncRNA进行敲除。针对lncRNA某条片段的两端分别设计多条sgRNA序列，实现大片段删除，从而达到敲除的效果。将sgRNA序列构建入病毒载体中，再将Cas9序列装入另一载体中，随后两种病毒同时感染目的细胞进行敲除。

　　

　　lncRNA靶基因寻找：方法基本类似于上面表述的miRNA双荧光素酶检测。

　　

　　3.circRNA: circRNA即环形RNA（circular RNA）的简称，是一类不具有5’末端帽子和3’ 末端poly（A）尾巴、并以共价键形成环形结构的客观存在于生物体内的非编码RNA分子。

　　

　　circRNA主要特征：

　　

　　（1）circRNA由特殊可变剪切产生，大量存在与真核细胞的细胞质中，主要来源于外显子，少部分内含子来源的circRNA存在细胞核中。

　　

　　（2）表达水平具有种属、组织、时间特异性。

　　

　　（3）circRNA呈闭合环状结构，不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更加稳定。

　　

　　（4）具有一定序列保守性。

　　

　　（5）在转录或转录后水平发挥调控作用。

　　

　　（6）绝大多数circRNA是非编码的，但也有少数可以翻译为多肽。

　　

　　circRNA根据其来源可分为三类：外显子来源的circRNA（exonic circRNAs），内含子来源的circRNA（circular intronic RNAs，ciRNAs），以及由外显子和内含子共同组成的circRNA（retained-intron circRNAs）。

　　

　　circRNA的作用机制：

　　

　　miRNA分子海绵，circRNA含有大量的miRNA结合位点，具有miRNA海绵作用，进而间接调控miRNA下游靶基因的表达。

 

　　
 

　　调控基因转录，circRNA也可以通过与RNA结合蛋白的结合来调控蛋白功能，比如通过与转录因子的结合来抑制基因的转录。

　　

　　编码功能，circRNA虽然属于非编码RNA，但是也有少数circRNA可以编码多肽，通过该多肽行使调控功能。

　　

　　circRNA过表达：同上述的lncRNA步骤类似，但是circRNA过表达由于成环效率的影响，其难度相对普通基因的过表达更大。

　　

　　circRNA干扰：同上述的lncRNA方法步骤。

　　

　　circRNA敲除：同上述的lncRNA方法步骤。

　　

　　circRNA靶基因寻找：同上述的miRNA和lncRNA双荧光素酶检测方法。

　　

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