4D-DIA

DIA主要采用数据非依赖采集模式（DIA），结合传统的数据依赖采集模式（DDA）构建参考谱图库，通过液质联用技术（LC-MS/MS）将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。随后利用搜库软件进行蛋白组学的鉴定、定量分析等。

技术优势

灵敏度高，无歧视地获得所有肽段的信息，不会造成低丰度蛋白信息的丢失，
循环时间固定，扫描点数均匀，定量准确度高，
重复性好，重复样品间的定量相关性可达到0.99以上。

分析内容

1. 数据质控
2. 蛋白功能注释：GO 注释、COG 注释、KEGG 注释、结构域注释
3.蛋白定量分析：蛋白定量结果、蛋白表达水平聚类分析、重复性分析
4. 蛋白差异分析：蛋白差异分析结果、差异蛋白火山图、差异蛋白聚类热图
5. GO 富集分析：GO 富集结果、GO 富集柱状图、GO 富集有向无环图、
6. KEGG 富集分析：KEGG 富集结果、KEGG 富集气泡图、KEGG 富集通路图
7. 结构域富集分析：结构域富集结果、结构域富集柱状图、差异蛋白互作分析、
8. 差异蛋白互作分析
9. 转录组关联分析

代表性文章

【1】Collins B C , Hunter C L , Liu Y , et al. Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry[J]. Nature Communications, 2017, 8(1):291.
【2】Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966.

案例展示

蛋白定量DIA用于慢性疼痛的研究
Standardized Profiling of The Membrane-Enriched Proteome of Mouse Dorsal Root Ganglia (DRG) Provides Novel Insights Into Chronic Pain

研究背景

慢性疼痛是一种治疗方案有限的复杂疾病。虽对其发病机理进行了多次研究，但各结果间存在较大不一致性，主要受限于传统蛋白质组shotgun技术固有的缺陷。发病机制依然不清晰。

实验设计

炎症性疼痛和神经性疼痛两种模型鼠及其对应control鼠共4组，各3个生物学重复
每个生物学重复由10-13只鼠pooling而成
解剖获得同侧背根神经节膜部分提取蛋白进行DIA蛋白定量

图1 实验设计类型

主要发现

1）DDA建库鉴定到3067个蛋白，迄今鉴定数最多的背根神经节蛋白研究。
2）DIA四组都鉴定到的蛋白有2526个，其中CFA和Vehicle都鉴定到的有2581个；SNI和Sham都鉴定到的2600个，表明实验重复性较好。
3）炎症性和神经性疼痛差异蛋白分别为64和77，两种模式共有差异蛋白为12个。
4）其中Serca蛋白在两种模式小鼠中表达量变化相反，表明两种疼痛的调控机制不同。
5）western blot和免疫组化对上述DIA结果进行了验证。

图2 四组实验模型的蛋白聚类分析

参考文献

Rouwette T , Sondermann J , Avenali L , et al. Standardized profiling of the membrane-enriched proteome of mouse dorsal root ganglia provides novel insights into chronic pain[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2016, 15(6):mcp.M116.058966.

结果展示

结构域注释柱状图

Interproscan是蛋白质结构域和功能注释最常用的软件之一。为了能更全面的进行结构域的注释，Interproscan整合了一些最常用的结构域数据库，包括 Pfam、 ProDom、 SMART 等结构域的数据库，利用模式结构或特征进行功能未知蛋白的结构域注释，绘制结构域注释的柱状图。横坐标代表蛋白数目，纵坐标代表注释到的 IPR 条目。

蛋白表达水平聚类图

蛋白表达水平聚类分析用于判断不同实验条件下蛋白表达量的相关性。每个样品都会得到一个绝对或相对蛋白表达集合，将所有样品表达集合并在一起，用于层次聚类分析和 K-means 聚类分析。

KEGG 富集通路图

在 KEGG 通路图中，圈出了差异蛋白，其中绿色底色框内为鉴定出的总蛋白，蓝色框标记的是下调差异蛋白，红色框标记的是上调差异蛋白，黄色框标记的是通路中该功能对应的多个蛋白中既有上调差异蛋白、也有下调差异蛋白。

差异蛋白互作分析

利用 StringDB 蛋白质互作数据库进行鉴定蛋白的互作分析，若在数据库中有相应的物种，则直接提取相应物种的序列，若无，则提取近源物种的序列，然后将差异蛋白的序列与提取出的序列进行 blast 比对，得出相应的互作信息，构建网络图。

常见问题

1. 蛋白定量DIA和传统的非标记定量有何优势？

传统的非标记定量一般需要通过分级的方法开展，耗时久、重复性差、数据结果可信度不高；蛋白定量DIA技术是新一代非标记定量技术，可通过更优的数据采集模式，在相同时间采集到更丰富的信息，压缩周期的同时，大福度提高样本间平行比较的重复性，数据结果可信度极高。

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