药物载体|人工改造的外泌体传递miRNA和化疗药物逆转了肿瘤的耐药性

   结直肠癌（CRC）是世界范围内第三大致死癌症，由于其侵袭性强、预后差和缺乏靶向治疗，因此发病率较高。基于5-氟尿嘧啶（5-FU）的化疗在CRC的治疗中起了重要作用。然而，由于长期使用5-FU会产生多药耐药性（MDR），从而严重削弱了治疗效果[1, 2]。
   最近，科学家们发现癌症耐药株中miRNA在耐药性方面起了重要作用，且药物抗性的分子靶点和机制也被阐明[3, 4]，如miR-21可通过下调CRC中人类DNA MutS homolog2（hMSH2）诱导对5-FU的耐药性[5]。文献进一步报道，恢复失调的miRNAs可以有效克服耐药性。因此，作者推测共传递MDR-reversing miRNA和化学治疗药物将是一种有望克服癌症化疗中MDR的有效方法。但是，安全有效的靶向给药系统是CRC治疗的关键。
   外泌体（exosomes）是由多泡体（MVB）与质膜融合时释放到细胞外环境的一种膜泡[6]，在不同细胞的外泌体中都可以检测到mRNAs、miRNAs和蛋白质的存在，以此挖掘外泌体介导细胞间通讯的潜在机制。文献报道了外泌体可以有效地传递生物药物，且通过分子途径可以靶向识别肿瘤细胞，实现精准药物递送[7]。但是利用外泌体进行功能RNAs和化疗药物共递送尚未被分析透彻，还需要进一步研究。
   近期东南大学肖忠党课题组通过对外泌体进行改造，同时用外泌体共递送5-FU和miR-21抑制剂（miR-21i）靶向结肠癌细胞，经体外和体内研究表明了用工程化外泌体递送5-FU和miR-21i可有效逆转耐药性，并显著增强了5-FU耐药癌细胞的毒性[8]。    银河集团官网 生物可提供从实验设计、外泌体分离、外泌体鉴定、外泌体高通量检测、外泌体示踪到体内外功能验证的整体服务。

1.外泌体的分离和表征
   为了使外泌体具有靶向性，作者将Her2亲合体与人Lamp2的胞外N端融合，根据以前的研究，Lamp2蛋白在外泌体膜中被大量发现。再将该融合结构克隆到带有GFP的慢病毒载体中，形成了THLG，另外一种不含Her2亲合体的融合结构，克隆后形成了LG，作为对照（Fig.1a）。随后将THLG和LG转染到HEK293T中，THLG-293T或LG-293T细胞的荧光显微镜图片显示，THLG和LG嵌合体蛋白存在于颗粒膜和质膜中（Fig.1b）。从THLG-293T或LG-293T的培养上清中分别超离出外泌体（THLG-EXO 和LG-EXO），再用western对外泌体的标志物如CD63、CD9、CD81进行检测（Fig.1c）。为了验证LAMP2融合蛋白是否结合到来自母细胞的外泌体中，作者用anti-GFP抗体和WB检测了融合蛋白在母细胞和外泌体中的表达。如Fig.1c所示，融合蛋白（LG）的分子量大约在80kDa，而THLG融合蛋白略高于LG，这与糖基化LAMP2和GFP的分子大小之和一致。此外，结果显示LG和THLG在HEK293T中均有高表达，并能整合到外泌体中。相比之下，在转染GFP的HEK293T细胞的外泌体中没有检测到GFP的水平，说明细胞质中的GFP可能没有整合到外泌体（Fig.1d）。此外，上述结果证明了含有GFP的融合蛋白存在于外泌体中，并对THLG-EXO和LG-EXO进行检测，结果显示可以在激光扫描共聚焦纤维镜下观察到GFP。这一结果进一步表明了融合蛋白成功地整合到外泌体中（Fig.1e）。
   然后利用透射电镜（TEM）和动态激光散射光谱（DLS）对外泌体的形态和大小进行了评价。其中，THLG-EXO具有典型的碟状双层膜结构，直径为60-130nm（Fig.1f）。DLS结果显示外泌体的大小分布较窄，平均直径为97nm，而THLG-EXO在装载了5-Fu/miR-21i后大小为110nm（Fig.1g）。 2.含miR‑21i和5‑FU外泌体的制备
   接下来，作者评估了THLG-EXO作为共递送5-FU和miR‑21i的载体的可行性。之前的一些结果表明，使用电穿孔可以有效地将化疗药物和外源短RNAs引入EVs。在本次研究中，作者也使用了电穿孔的方法将miR‑21i和5‑FU装载入外泌体中。为了获得最佳的电穿孔参数，作者测试了不同的电压和脉冲长度对电穿孔效率的影响。结果表明，当时间常数为10ms，电压为1000V时，装载效率最高。电穿孔后，THLG-EXO/5-FU/miR-21i的体积在miR-21i和5-FU负载的外泌体的形态上显示出一些细微的差异，包括略大的平均直径（110±11.3nm）(Fig. 1f, g)和表面电位（11±2.7mV）。而TEM照片显示THLG-EXO的平均直径为97±6.2 nm，表面电位为−8±2.4 mV。关于这些变化，作者推测这是在外泌体中电穿孔miR-21i和5-FU的结果，因为所有用于产生外泌体的其他程序都是相同的。在最佳电穿孔条件下，HPLC和qRT-PCR结果表明，外泌体的5-FU和miR-21i负载量（LC）分别约为3.1%和0.5%。
3.THLG-EXO的体外靶向性
为了分析THLG-EXO在体外的潜在靶向能力，作者建立了Her2阴性的SGC-7901 WT细胞和Her阳性的Her2-mcherry-SGC-7901细胞共培养模型并进行了评价(Fig. 2a)。荧光显微镜结果显示，与SGC-7901 WT细胞相比，THLG-EXO与Her2-mcherry-SGC-7901细胞共培养3h后，THLG-EXO能更有效地进入Her2-mcherry-SGC-7901细胞。相比之下，LG-EXO在Her2-mcherry-SGC-7901细胞中没有表现出这种特异性的定位，且在共培养模型中随机分布(Fig. 2b)。此外，利用流式细胞仪定量分析了THLG-EXO的细胞摄取情况。图Fig. 2c所示，与THLG-EXO共培养3h后，GFP阳性的Her2-mcherry-SGC-7901细胞增加了92.9%，而SGC-7901细胞则为18.6%，差异具有统计学意义（p<0.01）。相比之下，与LG-EXO共培养3h后，GFP阳性的Her2-mcherry-SGC-7901细胞百分比仅增长了1.4%，而SGC-7901细胞比例为1.2%。这些结果表明使用T-Her2作为Her2的配体可以显著地增强外泌体靶向细胞的能力。 4.THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i的体外抗肿瘤作用
   上述结果表明，工程化外泌体能有效地被受体细胞吸收。随后，作者研究了包裹了miR-21i和5-FU的THLG‑EXO诱导的生物学效应以及miR-21i和5-FU对5-FU耐药的结肠癌细胞系的协同细胞毒性。HCT-116的5-FU耐药株是在5-FU浓度逐渐增加的情况下，由这些细胞连续传代产生的。首先，作者研究了THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i传递寡核苷酸进入靶细胞的能力。如Fig.3a所示，HCT-116^5FR与THLG‑EXO/miR‑21i共孵育6h后，其内源性miR-21水平显著降低，而与游离的miR‑21i共孵育后并没有出现这种情况，说明与游离的miR-21i共孵育后并没有寡核苷酸进入HCT-116^5FR细胞。为了进一步证实THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i中miR‑21i在HCT-116^5FR细胞中诱导的生物学功能，作者评估了miR-21下游靶基因的表达水平，如hMSH2和PTEN。如所预期的，与THLG-EXO处理的细胞相比，HCT-116^5FR细胞用THLG-EXO/5-FU/miR-21i处理后，hMSH2和PTEN的蛋白表达水平增加（Fig.3b）。这些结果表明THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i可以有效地将miR-21i传递到受体细胞的细胞质中，且能特异性地沉默受体细胞中miR-21的生物学功能。
   接下来，为了评估THLG‑EXO介导的5-FU和miR-21i共递送的协同抗肿瘤效果，作者研究了5-FU浓度为5ug/ml时HCT-116^5FR细胞的凋亡、细胞周期和增殖情况。如Fig.3c所示，与装载了miR-21i或5-FU的THLG‑EXO共孵育后，HCT-116^5FR细胞的凋亡率分别达到12.6%和26.2%。显然，与mock-THLG-EXO处理组相比，只递送miR-21i并不能达到理想的治疗效果。相比之下，THLG-EXO介导的5-FU和miR-21i共递送引起的细胞凋亡率（凋亡率约42.3%）要高于THLG-EXO/5-FU处理的细胞组（凋亡率约26.2%），这说明了协同效果对靶细胞的凋亡影响最强。
   随后，通过PI对细胞周期进行评估，结果显示，与THLG‑EXO相比，THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i对HCT-1165FR细胞的S期阻断显著，而THLG‑EXO/miR‑21i对HCT-116^5FR细胞周期分布没有明显的影响（Fig.3d）。值得注意的是，与THLG‑EXO相比，THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i对HCT-116^5FR细胞的G1期也有一定程度的影响，但是这种效果没有对S期明显。此外，作者还分析了THLG‑EXO/miR‑21i、THLG‑EXO/5‑FU、THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i抑制癌细胞增殖的能力。结果显示，这三种外泌体都可以抑制细胞的增殖，但是随时时间的推移，它们对细胞增殖的影响有明显的差异。如Fig.3e所示，与THLG‑EXO/miR‑21i、THLG‑EXO/5‑FU、THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i共培养6天后，细胞增殖分别被抑制了约12%、43%和82%。这个结果表明，虽然THLG‑EXO/5‑FU具有较强的抑制生长的作用，但是THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i对细胞增殖的抑制作用更强，几乎完全抑制了细胞的增殖。而用THLG‑EXO/miR‑21i处理的细胞增殖略有下降。这与作者在细胞周期阻断和凋亡结果上的发现一致。因此，研究结果揭示了miR‑21i可以提高HCT-116^5FR细胞对5-FU的敏感性，并且与单药剂治疗相比，5-FU与miR-21i联合治疗可以显著提高5-FU对HCT-116^5FR细胞的抗肿瘤作用。 5.THLG‑EXO在体内的分布情况
   THLG‑EXO介导的miR‑21i和5‑FU对Her2阳性癌细胞的共递送已显示理想的体外递送效果。随后，作者用体内成像系统评估其体内递送效率。为了阐述体内靶向肿瘤的能力，作者在BALB/c雌性裸鼠的皮下接种了HCT-1165FR细胞。之后，用DiR染料标记THLG‑EXO和LG‑EXO，经尾静脉注射入裸鼠体内。在不同的时间点监测注射的外泌体的生物分布情况。如Fig.4所示，在注射后的最早时间点（30min），THLG‑EXO和LG‑EXO迅速分布全身，不同的是，THLG‑EXO在肿瘤内分布比较多，说明THLG‑EXO在肿瘤区域内能快速积累，而LG‑EXO主要分布在肝脏，这表明了LG‑EXO吸收和保留主要发生在肝脏和其他代谢器官，没有在肿瘤区域积累。此外，随着时间的推移，在这两组之间发现了显著的差异。在注射THLG‑EXO 3小时后，肿瘤区域能检测到较强的荧光信号，而小鼠身体其他部位的英冠光信号逐渐减弱。此外，在注射LG‑EXO 6小时后，足部和颈部仍可检测到相对强烈的荧光信号。相比之下，THLG‑EXO组在这些部位没有检测到信号，而荧光信号仅在肿瘤部位检测到了。综上所述，这些数据表明THLG‑EXO可以作为靶向Her2表达肿瘤细胞的有效药物载体。 6.THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i的体内抗肿瘤作用
   体外实验显示THLG‑EXO具有高效靶向肿瘤细胞给药的能力，以及miRNA调控与5-FU治疗的协同作用，随后作者也在体内用这种多组合方法评估是否能增强抗肿瘤作用。作者将HCT-1165FR-Luc诱导的肿瘤雌性裸鼠随机分成四组并给予注射药物制剂，包括THLG‑EXO/5‑FU/miR‑21i、THLG‑EXO/5‑FU、THLG‑EXO/miR‑21i及THLG‑EXO对照组。作者用肿瘤部位的生物荧光强度估计肿瘤大小。与预期一样，THLG-EXO/5-FU/miR-21i组效果最佳，即肿瘤体积随时间显著缩小。如Fig.5a所示，其他的治疗仍有不同程度的肿瘤扩大，尤其是THLG-EXO组，恶性肿瘤转移比较明显。通过测量相对发光强度，定量各组小鼠的平均发光强度（BLI）（Fig.5b）。在研究结束时，处死小鼠，切除肿瘤并称重。如Fig.5c所示，显然，与注射THLG-EXO和THLG-EXO/5-FU的小鼠相比，注射THLG-EXO/5-FU/miR-21i的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，肿瘤重量下降。
   为了进一步评估不同外泌体在肿瘤中诱导的细胞凋亡情况，作者采用TdTdUTP标记（TUNEL）染色分析细胞凋亡。如Fig.5d所示，静脉注射THLG-EXO/5-FU或THLG-EXO/5-FU/miR-21i后，TUNEL阳性细胞数量明显增加，其中THLG-EXO/5-FU/miR-21i组尤为明显。静脉注射THLG-EXO/miR-21i后，TUNEL阳性细胞数略有增加，表明了仅使用miR-21i对细胞凋亡影响不大。然而，工程化外泌体同时结合miR-21i和5-FU可以得到非常显著的抗肿瘤作用。随后，作者通过WB检测了外泌体传递的miR-21i的基因调控活性。如Fig.5e所示，THLG-EXO/miR-21i和THLG-EXO/5-FU/miR-21i能提升肿瘤组织中hMSH2和PTEN的蛋白表达，而THLG-EXO单独递送5-FU对hMSH2和PTEN的表达几乎没有明显的影响。这些体内的实验结果与细胞内的体外实验结果呈正相关，并且发现THLG-EXO介导5-FU和miR-21i共递送，对肿瘤的作用效果最好。 7.体内的安全性评估
   除了治疗效果，毒性是一个优良载体进一步使用需要考虑的另一个关键参数。出于安全考虑，作者每隔一天静脉注射20mg/kg 剂量的THLG-EXO，持续一周后评估THLG-EXO是否对健康BALB/c小鼠的全身系统产生毒性。与PBS组相比，实验组在研究期间没有观察到小鼠的死亡和严重的体重下降（数据未显示）。众所周知，经静脉注射的纳米级脂泡大部分被单核吞噬细胞系统（MPS）吸收和清除。因此，作者进一步研究了外泌体对这些器官诱发的潜在病理损伤。用血液生化和血液学分析外泌体对处理小鼠的任何潜在毒性作用。作者检测了不同生化指标，包括肝功能指标如谷丙转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST），肾功能指标如肌酐（CRE）、血尿素氮（BUN）。从表1中可以看出，上述各项指标均与PBS处理组相同，说明THLG-EXO在给药方案中没有明显的肝或肾毒性。血液学检查包括白细胞（WBC）、红细胞（RBC）和血小板计数。上述参数中THLG-EXO处理组与PBS组比较均无显著性差异（Table 1）。此外，如Fig.6所示，在THLG-EXO处理组中心脏、肝脏、脾脏、肺、肾等主要组织未见明显的组织病理学异常或病变，这说明了THLG-EXO没有引起炎症反应。这些结果表明，THLG-EXO多次给药对小鼠血液系统和主要器官不会引起急性毒性。 结论：
   在本篇研究中，作者成功开发了一种联合策略，利用工程化外泌体的传递系统，同时将miR-21i和化疗药物5-FU传递给HCT-1165FR癌细胞，有效逆转了耐药性，提高了肿瘤治疗的作用。
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