新冠病毒受体ACE2原来也能通过外泌体对内皮细胞起保护作用

   氧化应激被认为是内皮/血管功能障碍的主要因素，这在许多心脑血管疾病中都有发现。有文献报道，经缺氧处理的内皮细胞（ECs）和缺氧缺葡萄糖处理的脑切片模型中活性氧（ROS）的产生增加了。此外，氧化应激还与衰老相关的血管功能障碍有关。因此，减轻氧化应激是改善血管功能进而治疗血管疾病的重要策略，尤其是老年人。

   血管紧张素转换酶2 (ACE2)是肾素-血管紧张素系统的负调节因子，通过将血管紧张素II (Ang II)转化为血管紧张素，参与血管功能的调节。ACE2/血管紧张素信号传导可以预防血管功能障碍和氧化应激。文献中提出，ACE2过表达可减少小鼠的缺血性脑损伤，而ACE2缺乏会增加成年小鼠大脑动脉的氧化应激和内皮功能障碍。此外，文献还发现ACE2对内皮祖细胞（EPCs）具有保护作用。在EPCs中过表达ACE2（ACE2-EPCs）可减少细胞凋亡、减轻氧化应激和改善EPC功能。EPCs是骨髓来源的祖细胞，具有向ECs分化的能力，在维持内皮功能和止血方面发挥重要作用。

   外泌体是一种胞外囊泡，它们可通过递送蛋白质和microRNAs介导细胞间通讯。近期文献发现，干细胞来源的胞外囊泡能传递其母细胞的特性，如来自健康对照组的EPCs来源的囊泡通过其携带的miR-126对糖尿病患者的EPCs功能具有保护作用。但是，ACE2-EPC-EXs在衰老过程中对氧化应激的调节作用仍然未知。

   在本篇研究中，作者想观察出相比年轻的ECs，ACE2-EPC-EXs是否通过miR-18a/Nox2/ROS途径能更好地保护衰老ECs抵抗缺氧/复氧（H/R）诱导的氧化应激。

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实验结果
 

1.衰老ECs的特征

   为了估算衰老的开始时间，作者用细胞衰老的标志物SA-β-gal进行染色观察。结果显示，与对照组ECs相比，用Ang II刺激的细胞其SA-β-gal染色明显增加（Fig. 1A），表明了EC衰老模型的建立是成功的。同时作者也发现在衰老ECs中p16水平显著增加（Fig. 1B）。值得注意的是，在衰老的ECs中，ACE2和miR-18a的水平都下降了（Fig. 1D）。Ang II诱导EC衰老，引起ROS过量产生（Fig. 1C）和ECs的成管能力受损（Fig. 1E）。

Fig. 1 Ang II诱导的EC衰老模型特征

2.EPCs转染ACE2后，使得ACE2-EPCs及其释放的外泌体中ACE2和miR-18a水平升高

   如Fig. 2A和B所示，与EPCs和EPC-EXs相比，ACE2-EPCs和它们释放的外泌体中ACE2的的mRNA水平显示是上调的，这表明ACE2-EPC-EXs成功产生了。同时，miR-18a水平在ACE2-EPCs和ACE2-EPC-EXs中也是增加的，这说明了miR-18a在ACE2-EPC-EXs中的潜在作用。在ACE2-EPCs中使用miR-18a抑制剂来敲低miR-18a水平并不会改变ACE2的表达，但会下调ACE2-EPCs和ACE2-EPC-EXs中miR-18a的水平。ACE2抑制剂DX600可抑制ACE2-EPCs和ACE2-EPC-EXs中ACE2诱导的miR-18a升高。
根据NTA结果（Fig. 2C），四种类型的EXs在大小和浓度上没有显著差异，说明转染miR-18a抑制剂并没有改变ACE2-EPCs释放的外泌体。

Fig. 2 分析ACE2-EPCs及其释放的EXs中ACE2和miR-18a的水平，并评估EX的大小和浓度

3.ACE2-EPC-EX与ECs共培养会使ECs中ACE2和miR-18a水平增加

   如Fig. 3A所示，用PKH26标记的EXs在年轻和衰老的ECs细胞质中被发现，表明年轻和衰老的ECs都可以吸收EXs。为了阐明ACE2-EPC-EXs是否能将其携带的ACE2和miR-18a传递给ECs，作者用qRT-PCR检测与三种不同类型的EPC-EXs共培养后的年轻和衰老ECs中ACE2和miR-18a水平。作者数据（Fig. 3B）显示，与空载的vehicle和EPC-EXs共培养后的ECs中ACE2的mRNA水平没有差异。然而，与ACE2-EPC-EXs共培养后能显著提高ACE2水平，且在衰老的ECs中水平更高。在ECs中，ACE2-EPC-EXs共培养比EPC-EXs更有效地提高了miR-18a水平，而在衰老的ECs中则更高。此外，ECs与ACE2-EPC-EXs+DX600或ACE2-EPC-EXs^anti-miR-18a共培养后，其miR-18a水平下调，但是ACE2表达则没有变化（Fig. 3C）。

Fig. 3 ACE2-EPC-EXs与H/R损伤的ECs结合，改变了ECs中的ACE2和miR-18a水平

4.ACE2-EPC-Exs在减少ECs中H/R诱导的细胞凋亡和功能障碍方面比EPC-EXs更有效，对衰老的ECs效果更好
  为了确定ACE2-EPC-EXs是否能保护ECs免受H/R损伤，作者将不同类型的EPC-EXs分别与年轻的和衰老的ECs共培养来评估其凋亡率。如Fig. 4A所示，H/R诱导的衰老ECs的凋亡率高于年轻ECs。与未载EX的vehicle（H/R条件下培养）相比，EPC-EXs共培养显著降低了年轻和衰老ECs的凋亡。ACE2-EPC-EXs在降低H/R诱导的EC凋亡方面比EPC-EXs更有效。更重要的是，ACE2-EPC-EXs共培养会使年轻ECs的H/R诱导的凋亡率从30%降低到9%左右，使衰老ECs的H/R诱导的凋亡率从68%降低到17%左右，这个数据说明ACE2-EPC-EXs对衰老ECs的抗凋亡作用比年轻ECs效果更好。同时，作者也发现敲低miR-18a能部分抑制ACE2-EPC-EXs的抗凋亡作用。与ACE2-EPC-EXs+DX600共培养的ECs也有类似的作用。

   如Fig. 4B所示，血管生成实验结果显示，H/R可降低年轻和衰老ECs的成管能力，而EPC-EXs可改善这一情况。ACE2-EPC-EXs比EPC-EXs更能有效地改善H/R诱导的EC成管能力损伤。此外，ACE2-EPC-EXs显著提高了ECs的成管能力，年轻的ECs约140%，衰老的ECs约150%。ACE2-EPC-EXs+DX600和ACE2-EPC-EXs ^{anti-miR-18a​}会部分降低了ACE2-EPC-EXs的促血管生成作用，这说明了miR-18a参与了ACE2-EPC-EXs的促血管生成作用。

 

Fig. 4 ACE2-EPC-EXs在H/R损伤的年轻和衰老的ECs中能更好的减少细胞凋亡和改善ECs功能的作用，尤其在衰老的ECs中具有更明显的效果

5.ACE2-EPC-EXs在降低ECs中H/R诱导引起的ROS过量产生和Nox2表达方面比EPC-EXs更有效，对衰老的ECs有更好的作用

   为了确定ACE2-EPC-EXs是否可以通过减弱氧化应激来保护ECs免受H/R损伤，作者分析了与不同类型的EPC-EXs共培养后年轻的和衰老的ECs的ROS产生情况。如Fig. 5A所示，H/R诱导的ROS水平在衰老的ECs中比在年轻的ECs中要高。EPC-EXs共培养能降低年轻的和衰老ECs中ROS的过量产生。ACE2-EPC-EXs比EPC-EXs更有效地减少H/R诱导的ROS过量产生。更重要的是，ACE2-EPC-EXs共培养可减少H/R诱导的ROS过量产生，其中在年轻的ECs中减少约38%，在衰老的ECs找那个减少约55%，这表明了相比年轻的ECs，ACE2-EPC-EXs对衰老的ECs有更好的抗氧化作用。敲低miR-18a能部分阻断两种ECs中ACE2-EPC-EXs的抗氧化作用，对衰老ECs的抑制作用更强，这提示了miR-18a可能在ACE2-EPC-EXs的抗氧化作用中发挥关键作用。

Fig. 5 ACE2-EPC-EXs在降低年轻和衰老的ECs中由H/R诱导的ROS过量产生和增加NO下调方面具有更好的作用，尤其在衰老的ECs中效果更好

6.ACE2-EPC-EXs比EPC-EXs在提高H/R诱导的ECs中NO生成和eNOS表达下降方面更有效，对衰老的ECs有更好的作用

   作者也分析了与不同类型EPC-EXs共培养后年轻和衰老的ECs中CO产生和eNOS水平的情况。如Fig. 5B所示，与年轻的ECs相比，H/R降低了衰老ECs的CO水平。EPC-EXs共培养增加了年轻和衰老ECs中NO的产生。ACE2-EPC-EXs比EPC-EXs能更有效地增加NO的产生。此外，ACE2-EPC-EXs共培养可提高年轻ECs中NO的产生约81%，而衰老ECs中提高约91%，这也说明了与年轻ECs相比，ACE2-EPC-EXs对衰老ECs显示出更好的作用。敲低miR-18a在两种类型ECs中都部分阻断了ACE2-EPC-EXs的这种作用，对衰老ECs有更强的抑制作用。
   如Fig.6B所示，与年轻的ECs相比，H/R降低了衰老ECs中的eNOS水平。EPC-EXs共培养能显著增加年轻和衰老ECs中的eNOS水平。ACE2-EPC-EXs共培养可使年轻ECs的eNOS水平提高约143%，使衰老ECs的eNOS水平提高约166%，这表明与年轻ECs增加的eNOS水平相比，ACE2-EPC-EXs对衰老ECs中eNOS水平提高具有更好的作用。类似地，敲低miR-18a能部分阻断这种效应。总之，ACE2-EPC-EXs可以通过miR-18a/eNOS/NO通路改善H/R诱导的EC功能。

Fig. 6 在H/R条件下，ACE2-EPC-EXs能较好地降低年轻和衰老ECs的Nox2水平和增加eNOS水平，对衰老ECs有较好的疗效

   文章结论：

   在受到H/R损伤条件下，ACE2-EPC-EXs表现出对衰老的ECs比年轻的ECs有更强的抗氧化和抗凋亡作用，主要是通过其携带的miR-18a并随后下调Nox2/ROS途径实现的。进一步的实验还可以用于检测ACE2-EPC-EXs在体内的保护作用，并确定miR-18a的靶标。这些方法可能极大地提高我们对ACE2介导的缺血性脑卒中保护的分子基础的认识，并可能为开发新的治疗方法提供参考依据。
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