供稿人：舒易来团对
2022年2月23日，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来主任、李华伟教授与中国农业科学院（西安）农业基因组研究所左二伟研究员等团队合作在Cell Research期刊在线发表题为“Treatment of autosomal recessive hearing loss via in vivo CRISPR/Cas9-mediated optimized homology-directed repair in mice”的研究论文。该研究以腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）作为高效的基因治疗递送载体，转染听觉内毛细胞，用一种优化的HMEJ（同源臂介导的末端接合）的基因敲入方法精准修复Klhl18lowf耳聋模型的点突变，实现在体Klhl18lowf基因有效编辑，恢复感受声音的内毛细胞静纤毛形态，并纠正耳聋小鼠模型的听觉功能长达治疗后6个月。这是正式启动应用场景CRISPR/Cas9-HMEJ技术工艺改善隐性隐性基因性惑音面神经性聋非常成功的论述，为隐性基因性耳聋的深度贫困改善甚至诊疗转为给予了强坚实的地理学出轨证据。
据地球卫生管理组建（WHO）企业官网简报，不超全世界常住人口的5%，即4.6亿元人身患致残性英语听力心理障碍，当中3400万是小朋友。既然研究方案看见不超120个DNA或非综合性管理征型或综合性管理征型耳聋相关联（//hereditary hearing loss.org/），但临床护理上相对隐性基因迷人音精神性聋的控制除去配带老年助听器和着床机器耳蜗等，尚未其余更有效的抗癫痫药物控制途径。在非整体征型隐性基因性耳聋中，常上色体隐性隐性基因性耳聋占80% (Korver et al., 2017)。
对于那些隐性隐性染色体性耳聋，最佳的的通过治疗方法做法是对染色体变异位点通过脱贫攻坚地休复，随之经久地恢复功能听力测试。CRISPR/Cas9染色体剪辑设计是近来来迅速发展的最新型染色体剪辑APP，已在疫情的通过治疗方法中体现出了大的适用发展潜力。该设计主要是的由sgRNA和Cas9好几部分成小组成，这二者方法养成包覆体， sgRNA与靶位点反向的方式给回相辅相成确保位置定位后，还快速精确PAM编码序列，Cas9核酸酶分割DNA，导至DNA情况折断。细胞系内主要是的有二者DNA损坏休复缘由，非同源下端连入（Non-homologous end-joining，NHEJ）和同源重新组合清理（Homologous recombination，HR）。当有外源性DNA模板图片都存在时，根据HR能保持队列的同时精度切换一些定向读取，但其学习的效率低，需要在非瓦解血细胞中，HR的学习的效率更低，这很大局限了HR在表观遗传的治疗教育领域的操作。
深入分析销售团队在原本的深入分析中通快递过在同源模板定制开发更替转化sgRNA的靶位点，定制开发好几个种以同源臂介导的端部连结（Homology-Mediated End Joining，HMEJ）为基本的染色体敲入策咯 (Yao et al., 2017)，在内部、体内均满足了便捷而精准的整和（图1）。HMEJ介导的染色体遗传染色体组敲入方法步骤为收录染色体遗传染色体组我们两栖动物3d模型的制定和染色体遗传型重大疾病的脱贫攻坚靶向药物染色体遗传染色体组诊疗等提拱了广大的非常好。现在，尚未应用于CRISPR/Cas9介导的HR政策通过耳聋染色体遗传染色体组诊疗的自身调查。
图1 设定制作HMEJ同源重新组合方法方案格式。a 采取淘汰的sgRNA，设定制作HMEJ同源臂。b 应广泛用于AAV做为人体内递送承载的双AAV方法体系中，里面两个AAV递送广泛用于呈现Cas9的承载，另两个递送呈现sgRNA与随身携带同源臂的承载。
Klhl18lowf小鼠模型
Klhl18lowf小鼠模型是指Klhl18 p.V55F发生错义点突变（Chr9:110455454 C>A），其纯合子小鼠表现为第4周开始出现以低频为主的渐进性听力下降，随着年龄增长，听力下降逐渐累及其它频率，最后发展为全频型严重耳聋，而杂合子小鼠听力正常，表现为隐性遗传。Klhl18lowf隐性遗传性耳聋小鼠模型在形态学方面表现为耳蜗内毛细胞纤毛的形态异常 (Ingham et al., 2021)。
CRISPR/Cas9-HMEJ系统
该研究首先针对基因Klhl18lowf突变位点设计、筛选和构建了HMEJ治疗体系。在新生小鼠皮肤成纤维细胞中进行体外sgRNA筛选，发现sgRNA2的效率较高。将表达Cas9的质粒与携带HMEJ同源模板和表达sgRNA2的质粒共同转染至带有Klhl18lowf突变的成纤维细胞中，发现突变位点明显得到了的纠正，且sgRNA2不产生明显的脱靶编辑。
应用场景CRISPR/Cas9-HMEJ安全体系休内核实
体外实验证实设计的HMEJ系统可以精确纠正Klhl18lowf点突变后，该研究进一步在体内探索该系统的疗效。用双AAV包装CRISPR/Cas9-HMEJ基因修复体系，即AAV9-SaCas9-KKH和AAV-PHP.eB-sgRNA-donor，将其在Klhl18lowf新生鼠出生后1天（P1）显微肌内注入至小鼠的内耳。在小鼠P14和10周龄时，肚子里剪辑错误率加测最终反映出，双AAV医疗程序在体完成修护了Klhl18dnaC>A点转变，随之剪辑精力的不断增加，10周龄的修护错误率增强了约3倍，而在未肌内注入耳中，不洞察分析到严重的碱基插进、欠缺或转变碱基的修护。用扫描器电镜枝术，与也是型小鼠优于，得知8周龄的未医疗纯合转变小鼠的内孔状管胞是非常高的并排静纤毛行为为更长、更细且上方成尖细的椎型，而医疗后的小鼠有局部内孔状管胞的静纤毛康复顺利的形式，行为为是非常高的并排静纤毛大局部呈柱形且更短。在医疗后小鼠耳蜗的顶圈和中圈，总值约16%的内孔状管胞体现了顺利或贴近顺利的纤毛束形式。听性脑干化学反应（auditory brainstem response, ABR）测试结果显示注射AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治疗体系后8周，注射耳的ABR阈值在8、16、24和32 kHz均比未注射耳明显下降，且治疗效果持续至小鼠24周龄（工作查看期）。电人体生理查重最后表现，在较长时光（200 ms）的去极化脉冲刺激条件下，未注射耳的内毛细胞膜电容与野生型相比明显下降，而AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治疗体系能将注射耳内毛细胞膜电容恢复至野生型水平，即治疗体系修复了内毛细胞持续囊泡释放功能。
综上所述，基于CRISPR/Cas9-HMEJ策略可对体内内耳毛细胞中的基因突变位点进行精准的纠正，恢复了耳蜗部分内毛细胞静纤毛形态、修复了内毛细胞持续囊泡释放功能并持久改善了Klhl18lowf隐性遗传性耳聋小鼠的听觉功能，为最终在人类隐性遗传性耳聋及其它器官系统隐性遗传性疾病中实现安全、持久的基因治疗提供了科学依据和参考。
复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来研究员、李华伟教授和中国农业科学院（上海）农业基因组研究所左二伟研究员为共同通讯作者，顾晰博士后、胡新德博士后（中国内地地理院校精神地理学论述所）和王大奇医生后为共同的首小编。
