【Nat Commun.】华中科技大学朱铃强教授发现AD患者的罪魁祸首——miR-135a-5p

痴呆症是一种表现为记忆、思考、行为和日常活动能力衰退的综合征。世界卫生组织资料显示，全世界大约有5000万痴呆症患者，每年新增病例1000万。阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种与年龄相关的慢性中枢神经退行性疾病，是痴呆症最常见的形式，约占痴呆症病例的60-70%。中国痴呆患者人数居世界第一，据估计约有950万，到2030年中国痴呆患者将会达到1600万。AD主要的病理特征包括淀粉样蛋白聚集形成的老年斑(Senile plaques, SPs)、Tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结 (Neurofibrillary tangles, NFTs)以及大量神经元丢失。AD病程进展缓慢，早期症状常被认为是普通的健忘而被忽视。AD患者晚期认知功能能力逐渐丧失，伴随人格异常以及各种行为功能障碍，最终导致死亡。突触是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是信息传递的关键部位，神经元突触结构动态变化为学习记忆重要的结构基础。突触活动可以刺激蘑菇状树突棘（在突触传递和认知功能中起关键作用）的成熟并形成新的突触，使突触强度能够适应环境的变化，反过来又在学习和记忆中发挥重要作用[1-3]。AD患者中早期阶段就已经出现突触丢失和突触功能障碍，与SPs和NFTs相比，以突触丢失和突触活动降低为特征的突触功能障碍与AD的认知障碍有着更高的相关性[4-5]。因此，了解突触功能障碍的潜在机制将有助于开发早期AD的治疗药物。

MicroRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22bp的非编码单链RNA分子，具有在翻译水平调控基因表达的功能。miRNA参与多种生理病理过程，他们能够精确调节突触上突触相关蛋白的局部翻译。先前的研究发现，在AD患者的脑组织或血清中有大量miRNA表达失调，与淀粉样斑块和神经纤维缠结的形成以及突触可塑性异常相关。然而，这些miRNA导致AD突触功能障碍的具体机制仍然未知。

2021年3月26日，华中科技大学脑研究所、基础医学院病理生理系朱铃强教授、鲁友明教授研究团队在《Nature Communications》发表题为“miR-135a-5p mediates memory and synaptic impairments via the Rock2/Adducin1 signaling pathway in a mouse model of Alzheimer’s disease”的最新研究工作[6]。该研究发现，导致AD记忆混乱的罪魁祸首miRNA——miR-135a-5p，其通过调控下游靶蛋白Rock2异常活动，影响Add1在Ser726位点磷酸化水平，最终导致突触功能障碍及学习记忆能力受损。揭示了miR-135a-5p/Rock2信号通路参与AD早期突触病变，为AD治疗药物的开发提供新的思路。



结果


1、AD模型小鼠miR-135a-5p表达异常降低

首先，作者对AD模型小鼠海马组织中与突触活性相关的miRNA进行表达谱测序及筛选验证，结果发现，12月龄的AD模型小鼠中miR-135a-5p表达下调，而miR-136-3p、miR-19a-3p、miR-125b-5p和miR-26a-5p的表达明显上调（图1a），此外，9月龄的AD模型小鼠中只检测到miR-135a-5p的下调以及miR-125b-5p的表达上调（图1b）。这些数据提示了miR-135a-5p的下调或miR-125b-5p的上调可能参与调控AD疾病的早期发病过程。由于miR-125b-5p在AD中的功能障碍已得到充分的证明[7]。因此，研究人员将重点研究miR-135a-5p在AD突触紊乱中的可能作用。

随后，作者检测了不同年龄段的APP/PS1小鼠（AD模型小鼠的一种）海马区miR-135a- 5p水平的变化，发现，miR-135a-5p的这种下调从6月龄就开始存在了，只是在9月龄的模型小鼠中miR-135a-5p下调更为明显（图1c）。同时，借助荧光原位杂交技术发现，miR-135a-5p的表达下调主要发生在AD模型小鼠海马的兴奋性神经元中（图1d,e）。

进一步，作者在体外培养的原代神经元中过表达Tau、APP或PS1后，发现了miR-135a-5p水平下调的现象（图1f）。而在AD模型小鼠海马区Tau蛋白的表达水平与miR-135a-5p的表达水平呈负相关（图1g,h），这提示了miR-135a-5p在AD中的丢失具有Tau依赖性。

图1 AD模型小鼠海马区miR-135a-5p表达异常降低


为找到AD中miR-135a-5p下调的原因，作者首先通过放线菌素D阻断新RNA的合成来检测miR-135a-5p的稳定性，结果发现，在AAV-Tau感染的海马原代神经元中miR-135a-5p的半衰期与对照病毒感染的神经元相同（图2a,b），这提示了Tau过表达对miR-135a-5p的抑制不是由RNA降解功能障碍引起的。接下来，作者考虑了AD中miR-135a-5p的转录是否受到抑制，研究人员检测了Tau蛋白过表达的原代海马细胞核部分中miR-135a-5p转录本(pri-miR-135a-1/2)的水平，发现pri-miR-135a-1降低（图2c），在APP/PS1模型鼠中也发现了同样的现象（图2d），这提示了pri-miR-135a-1的转录受到抑制，可能是导致AD中miR-135a-5p表达下调的原因。进一步，作者通过双荧光素酶报告、ChIP及相关数据库发现，Tau蛋白诱导的miR-135a-5p表达下调是由于Foxd3转录因子减少导致的（图2g-l）。



图2  AD模型小鼠中miR-135a-5p表达下调是由于Foxd3转录因子减少导致


2、miR-135a-5p表达下调通过影响突触结构功能导致学习记忆障碍


接下来，作者借助AAV病毒载体在6月龄野生型小鼠海马区抑制miR-135a-5p（AAV- sponge（miR-135a-5p）），1个月后对小鼠的空间记忆和突触可塑性进行了评估（图3a,b），通过Morris水迷宫、巴恩斯（Barnes maze）迷宫、条件性恐惧实验（Fear Conditioning）行为学范式发现，抑制miR-135a-5p后，小鼠的空间记忆能力受损，学习记忆障碍，具有阿尔茨海默样表型（图3）。


图3 抑制miR-135a-5p的表达可导致小鼠学习记忆障碍


海马的突触可塑性是学习记忆的基础[8]，研究人员也发现抑制miR-135a-5p的表达后，CA3-CA1环路的突触传递功能出现了异常，即兴奋性突触后电位抑制从而导致了LTP（长时程增强）突触可塑性异常，而突触前囊泡释放并未受明显影响，提示了miR-135a-5p表达降低阻滞了突触传递（图4a-d）。同时，高尔基染色结果发现，miR-135a-5p表达下调后也会导致树突棘密度减少，尤其是在突触传递和认知功能中起关键作用的蘑菇状树突棘数量减少（图4e-g），此外，神经元树突复杂性也降低（图4h-j）。这些结果提示了miR-135a-5p表达水平降低导致AD小鼠中出现突触异常现象，miR-135a-5p可能通过影响突触结构功能进而影响学习记忆能力。


图4 抑制miR-135a-5p的表达可导致小鼠突触功能障碍


3、miR-135a-5p表达下调导致Rock2异常激活

miRNAs通过抑制其靶mRNAs的翻译或促进其降解来调控基因表达[9]。基于此，为明确miR-135a-5p介导AD突触紊乱的直接靶点，研究人员通过多个数据库对比发现四个潜在候选分子（Rock1、Rock2、Cacna1d和Pik3r2），而在APP/PS1小鼠中只有Rock2（Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶2）发生显著上调变化（图5a），提示了Rock2是介导miR-135a-5p表达下调导致的突触异常的潜在下游靶点。体外细胞实验结果发现，miR-135a-5p能直接与Rock2的3’UTR结合，miR-135a-5p的表达上调或下调能够调控Rock2的蛋白表达水平，提示了miR-135a-5p对Rock2具有直接调控作用（图5b,c）。

接下来，研究人员探讨了Rock2激活后介导的AD突触异常的潜在下游效应因子。借助生信分析，在9月龄的APP/PS1小鼠以及培养的海马原代神经元中均发现了内收蛋白1（adducin 1, Add1）的Thr445和Ser726的磷酸化显著增加（图5d,e）。同时，在AD患者和AD小鼠的额叶皮质中，磷酸化Ser726-Add1水平升高，并伴随着Rock2的表达水平增加，且miR-135a-5p与Rock2、Ser726-Add1磷酸化水平呈较强的负相关，而Rock2与Ser726-Add1呈正相关（图5f-i）。提示了miR-135a-5p的表达下调导致了Rock2的异常激活，进一步通过上调Add1在Ser726位点磷酸化水平使细胞骨架异常。



图5 miR-135a-5p的表达下调导致Rock2的异常激活


4、恢复miR-135a-5p/ Rock2信号通路可以改善AD的记忆损伤和突触功能异常



基于上述结果，研究人员进一步验证miR-135a-5p的上调或Rock2的下调是否可以改善AD模型小鼠的记忆损伤和突触障碍。通过向8月龄的APP/PS1小鼠海马注射LV-shRNA（Rock2）和miR-135a-5p的激动剂，发现这两种方式均能Rock2的表达、降低Add1在Ser726位点磷酸化水平、恢复树突棘的密度和复杂度，促进树突棘成熟（图6a-g），同时，突触传递功能及小鼠的学习记忆障碍也得到了改善（图6h-m）。


图6 过表达miR-135a-5p可改善AD小鼠的记忆损伤和突触障碍



最后，作者验证了阻断Add1的磷酸化水平是否可以改善AD模型小鼠的记忆损伤和突触障碍。通过体外验证，研究人员找到siP-Add1能减弱Add1的磷酸化水平（图7a），并通过腹腔注射于APP/PS1小鼠后发现siP-Add1可降低小鼠体内Ser726-Add1磷酸化水平，同时改善了阿尔兹海默样表型（图7b-o）。


综上，miR-135a-5p/Rock2信号通路也许就是介导AD早期突触功能异常以及记忆损伤的原因之一，恢复miR-135a-5p/ Rock2信号通路可以改善AD的记忆损伤和突触功能异常。



图7 siP-Add1可降低小鼠体内Ser726-Add1磷酸化水平，同时改善了阿尔兹海默样表型





结论

文中朱铃强教授/鲁友明教授研究团队借助病毒载体介导的基因过表达/干扰技术、分子生物学手段、多种行为学范式、生信分析、表达谱测序、双荧光素梅检测等技术手段发现，导致AD记忆混乱的罪魁祸首miRNA——miR-135a-5p。在AD的早期发病阶段miR-135a-5p表达下调，进一步其通过调控下游靶蛋白Rock2的异常激活，影响Add1在Ser726位点磷酸化水平，最终导致突触功能障碍及学习记忆能力受损。揭示了miR-135a-5p/Rock2信号通路参与AD早期突触病变，为AD治疗药物的开发提供新的思路。

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原文链接：http://www.nature.com/articles/s41467-021-22196-y

参考文献
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[3] Humeau, Y. & Choquet, D. The next generation of approaches to investigate the link between synaptic plasticity and learning. Nat. Neurosci. 22, 1536–1543(2019).
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[6] Kai Z, et al. miR-135a-5p mediates memory and synaptic impairments via the Rock2/Adducin1 signaling pathway in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nat Commun. DOI: http://doi.org/10.1038/s41467-021-22196-y
[7] Banzhaf-Strathmann, J. et al. MicroRNA-125b induces tau hyperphosphorylation and cognitive deficits in Alzheimer’s disease. EMBO J.33, 1667–1680 (2014).
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