哪些是外泌体

    什么是外泌体?

 

    外泌体(Exosomes)是上皮癌受损内部外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的一个，数值在30-150nm，由上皮癌受损内部内的多泡小体(Multivesicular bodies,MVB)与上皮癌受损内部相融合后其他分泌液的组织形式发出到上皮癌受损内部外，广泛的产生于上皮癌受损内部训练上清或者多种多样体液中，属于血浆、淋疤液、吐液、尿、男人的精子、奶汁等。

 

    为什么研究外泌体?

 

    外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递，调控细胞生理活动。同时，外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸、诱导正常细胞转化、促进肿瘤发生和转移等作用;此外，外泌体还可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送。

外泌体样本预处理与分离、保存：

　　外泌体存在于人类或动物的各种体液中，我们可以选择不同的样本来源进行相关的外泌体研究。由于外泌体是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡小体，分布于胞外基质。为了获得高纯度的外泌体，必须确保有效去除所有的细胞碎片及其他不需要的杂质。

　　1）细胞培养上清              2）血浆/血清

　　3）尿液                            4）脑脊液

　　5）卵泡液                        6）宫腔液

　　7）胆汁                            8）羊水

　　9）腹水                           10）胸腔液

　　不同的实验样本采集时需要注意的地方不一样，如细胞培养上清在收集样本前需换成无外泌体血清培养、血浆样本采集时用一定不能用肝素抗凝管、尿液收集时需要加抑菌剂等。

       从生物体液中分离外泌体的各种方法已经被开发出来，主要根据外泌体的大小、密度、免疫特性等特点进行操作。分离出高纯度的外泌体是我们后续开展外泌体研究的关键步骤，目前差速超速离心是外泌体分离方法中公认的“金标准”，也是高分文章中首选的分离方法。
 

外泌体超离大致步骤

       外泌体鉴定：

　　外泌体分离之后，需要经过一系列鉴定才能确定分离的是外泌体。鉴定方法从物理特征到表面分子标志物，多角度进行鉴定。

       (1) 透射电镜鉴定法：简称TEM，适合外泌体双层囊膜超微结构观察，即通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。
 

 外泌体透射电镜图
 

      (2) nm科粒跟踪软件解析法：通称NTA，该方式 能保护外泌体初始壮态、验测时间快，验测后能能提供外泌体粒级和浓硫酸浓度消息。
 

外泌体NTA图
 

      (3)Western blot原子核标准物判断：外泌体标准血清质其中包括四跨膜血清质一家，如CD9、CD63和CD81；体细胞系质血清质，如肌动血清质（Actin）和钙磷脂整合血清质（Annexins）；直接参与海洋生物功能性的原子核，如凋亡连接遗传基因组2互作血清质X（ALIX）、肉瘤易感遗传基因组101血清质（TSG101）、热感染性休克血清质（HSP70、HSP90），和体细胞系分泌量的特异形血清质。

外泌体Western Blot图（Tian Su et al., ACS Nano. 2019）
 

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      外泌体高通量检测

　　外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质和核酸，可以运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA等进入受体细胞，参与细胞间通讯。不同细胞来源的外泌体所含有的蛋白成分和RNA不太相同，可作为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。

　　1. miRNA高通量测序

　　2. 表达谱芯片（人、小鼠）

　　3. lncRNA芯片（人、小鼠）

　　4. ceRNA芯片（人、小鼠）

　　5. 蛋白质组分析（iTRAQ、TMT、Label-free）

　　

      外泌体示踪

 

      对分离处理的外泌体做离体标出或活体示踪，这样有利于正式泌体的系统做进一大步的研究分析。日前较常用亲脂性有机颜料正式泌体做标出，亲脂性有机颜料具体涉及几种，更是PKH67(环保)和PKH26，二DiI(橘黄色荧光)、DiO(环保荧光)、DiD(紫色荧光)、DiR(深紫色荧光)。

    ACS Nano. 2019 Feb 26;13(2):2450-2462.

 

      外泌体的作用钻研

 

      关察外泌体都具有什么样功能模块键，可不可以将外泌体会直接建立肾上腺素蛋白激酶组织组织提升基中，与肾上腺素蛋白激酶组织组织参与共提升，关察组织组织的功能模块键波动，或将外泌体肌注入宠物建模中，关察宠物表型波动和查重宠物相关因素，如肺部肿瘤适当转移、血糖能力、胰岛素脆弱性等。

    Nat Commun. 2018 Jan 15;9(1):191.